PCR analýza: čo to je, svedectvo a príprava na štúdiu

Metóda PCR alebo PCR sa používa pri laboratórnej diagnostike väčšiny infekčných chorôb. Umožňuje detekciu genetického materiálu mikroorganizmov v skúmanom materiáli a tým ich identifikáciu.


Čo je to

Metóda bola vyvinutá v roku 1983 av roku 1993 jej autor Mullis získal Nobelovu cenu.

Základy metódy

Analýza PCR odhalila jedinečný genetický materiál v testovanom materiáli, ktorý umožňuje identifikáciu mikroorganizmu.

Každý typ mikroorganizmu, rastliny alebo zviera má jedinečný súbor chromozómov. Sú tvorené DNA - deoxyribonukleovou kyselinou. Malé fragmenty DNA sa nazývajú nukleotidy a ich špecifická sekvencia predstavuje gén. Každý gén kóduje syntézu jediného proteínu, napríklad kolagénu, albumínu a všetkých ostatných. Sekvencia nukleotidov je jedinečná. Pre každý druh živých organizmov existujú spoločné oblasti DNA zodpovedné za jednotnosť v rámci tohto druhu.

Analýza DNA niekoľkých stoviek mikróbov zachytených v materiáli pre štúdiu neodhalídruhov. Je potrebné mnohokrát zvýšiť počet významných genetických zložiek, čo umožní ich identifikáciu. Tento problém je riešený metódou PCR.

Štúdia sa týka oblasti molekulárnej biológie. DNA-polymeráza a voľné nukleotidy sa pridajú do mikrobiálnej DNA. Polymeráza - enzým, ktorý poskytuje viacnásobné kópie požadovanej oblasti existujúcich nukleotidov. Spustite proces primérov - krátkych reťazcov ribonukleovej kyseliny (RNA) pripojených na začiatok požadovaného génu.

Proces analýzy pozostáva z niekoľkých fáz, z ktorých každá si vyžaduje určitý čas a teplotu. V priebehu niekoľkých hodín sa získa potrebné množstvo materiálu na analýzu z tisíciny gramu bakteriálnej DNA. Moderné vybavenie umožňuje opakovane kopírovať DNA aj jednej bunky, napríklad spermie.

Pokrok v oblasti výskumu

Stupne analýzy:

  • odber biologického materiálu (krv, moč, vaginálne sekréty, sliny atď.) Od pacienta a jeho dodanie do laboratória;
  • oddelenie dvoch reťazcov DNA, ktorých vzájomné spojenie tvorí chromozóm, a ich čistenie od nečistôt;
  • zdvojenie požadovanej časti reťazca DNA, v dôsledku čoho jeho počet exponenciálne rastie;
  • spracovanie získaného materiálu roztokmi, ktoré spôsobujú, že týmto farbením sa rozpozná špecifická luminiscencia získaných fragmentov DNA, pričom baktéria alebo vírus boli v zdroji; na oddelenie DNA frakcií použitímelektroforéza.

Trvanie analýzy je 4 - 5 hodín.

Výhody metódy PCR

Polymerázová reťazová reakcia má takéto výhody oproti tradičným metódam detekcie infekčných agens:

  • priame stanovenie génov mikroorganizmov na rozdiel odod detekcie protilátok k nemu v mnohých iných spôsoboch identifikácie;
  • špecifickosť, to znamená definícia špecifického typu patogénu;
  • citlivosť: na diagnostiku postačuje aj jedna bunka mikroorganizmu;Vo všeobecnosti je požadované množstvo patogénu 10-krát menšie ako pri iných spôsoboch;
  • univerzálnosť biomateriálu - vyšetruje sa nielen krv, ale aj bunky hustých tkanív, šrot z epitelu, sekrécie slizníc a akékoľvek iné médiá, kde môže byť mikrób;
  • rýchlosť získania výsledku je niekoľkokrát vyššia ako pri použití iných metód;
  • schopnosť rozpoznať chronické, pomalé a skryté infekcie;
  • dezinfekcia materiálu odobratého pacientovi a odstránenie infekcie laboratórnych pracovníkov;
  • úplná automatizácia výskumného procesu.

Nevýhody analýzy

Nevýhody PCR súvisia najmä s jej technickou zložitosťou:

  • je potrebné zvoliť správnu sekvenciu RNA- priméry, ako aj prípravu zmesi nukleotidov na syntézu DNA;
  • Metóda je veľmi citlivá, takže ak sú vo vzorke rôzne typy mikróbov, môže to viesť k nesprávnym výsledkom;
  • treba dôkladne vyčistiť.materiál z nečistôt z ľudských proteínov a liekov, pretože znižujú presnosť diagnózy;
  • vyžaduje kontrolné porovnanie výsledkov so vzorkami, o ktorých je známe, že obsahujú mikroorganizmy alebo materiál, a tiež neobsahuje vôbec DNA na stanovenie chýb a kontaminácie.

Falošne negatívne výsledky PCR sú spôsobené porušením analytickej techniky a zmenami v genetickej sekvencii ktorejkoľvek z reakčných zložiek. Falošne pozitívne údaje sa tiež vyskytujú - v prípade náhodnej koincidencie primérov nukleotidov a iných činidiel použitých s jedným z génov mikroorganizmu.

Izolácia mikroorganizmu nie vždy naznačuje, že ochorenie spôsobil on. Pri analýze ľudskej DNA existuje ďalší problém: genetický základ väčšiny chorôb je stále neznámy, čo zatiaľ neumožňuje diagnostikovať neinfekčnú patológiu na mikrobiologickej úrovni. Tento smer lekárskej genetiky sa vyvíja veľmi aktívne.

Indikácie pre štúdie PCR

Vo väčšine prípadov sa diagnostika PCR používa u pacientov s infekčnými chorobami s cieľom identifikovať mikroorganizmus, ktorý ochorenie spôsobil.

Táto analýza sa používa v takýchto situáciách:

  • potreba identifikovať a identifikovať vírusy, baktérie, prvoky pri všetkých infekčných chorobách, keď sa vyžaduje diagnostická presnosť;
  • diagnostika ľudských genetických chorôb ;
  • identifikácia v porovnaní sgenetický materiál známeho pôvodu;
  • analýza tkanív získaných biopsiami s jemnou ihlou , ktoré sa veľmi ťažko skúmajú inými metódami;
  • diagnostika leukémie a malígnych nádorov;
  • uskutočňovanie experimentov s prežitím embryonálnych kmeňových buniek u zvierat (u ľudí je používanie takýchto buniek zakázané), ako aj šľachtenie línií laboratórnych myší s vopred určeným genetickým ochorením.

Vyhliadky na použitie reakcie PCR a jej variantov v medicíne a biológii zachytávajú predstavivosť - od testovania nových liekov na úrovni génov až po vytvorenie transgénnych organizmov s požadovanými vlastnosťami. Práca v tomto smere sa vykonáva v najväčších laboratóriách sveta, čo pomáha zlepšiť metódu PCR a na aplikačnej úrovni pre diagnostiku ľudských infekčných ochorení.

V medicíne sa metóda PCR bežne používa na diagnostikovanie a hodnotenie účinnosti liečby týchto ochorení:

Príprava na štúdium

3 dni pred štúdiou je potrebné upustiť od používania alkoholických nápojov. Na predpis, niektoré lieky, ako sú antibiotiká, sú zrušené.

Pravidlá prípravydiagnostika infekcií genitálií:

  • 2 dni pred analýzou prerušiť pohlavie;
  • 2 hodiny pred štúdiou močiť;
  • noc pred a ráno sa nevypláca; umyte iba teplou vodou bez saponátov;
  • nepodliehajú PCR počas menštruácie a 4 dni po kolposkopii (u žien).

Všeobecné pravidlá prípravy:

  • za 2 dni nezahŕňajú intenzívne fyzické aktivity, šport;
  • nefajčite ani nejedzte jedlo od rána štúdie;
  • ak sa materiál odoberá z úst a nosohltanu - nečistite si zuby ráno.

Spoľahlivosť tejto presnej, ale nie lacnej diagnostickej metódy závisí od implementácie týchto jednoduchých pravidiel. Vlastná interpretácia výsledku neposkytne potrebné informácie o chorobe a jej liečbe. Preto je potrebné po získaní údajov z PCR štúdií konzultovať s lekárom.

Na ktorý lekár sa má obrátiť

Ak je podozrenie na pohlavne prenosnú chorobu, gynekológ, urológ, androlog, venereológ sa bude odvolávať na PCR. Štúdia o hepatitíde a infekcii HIV je predpísaná špecialistom na infekčné ochorenia a pri tuberkulóze lekárom TB. PCR vo svojej praxi používajú lekári mnohých špecialít, napríklad onkológovia, hematológovia, gastroenterológovia, genetika.

Užitočné informácie o analýze PCR:

Venerológ, urológ S.G. Lenkin hovorí o analýze PCR: